高等植物在生长发育过程中经常受环境胁迫影响。当细胞感受到信号刺激时，胞质游离钙离子浓度会发生短暂而复杂的变化，产生第二信使，将逆境信号传递下去(Shao et al., 2008)。研究表明，高等植物中的CBL (calcineurin B-like protein)蛋白，它能够和蛋白磷酸酶CIPK (CBL-interacting protein kinase)互作(Luan, 2009)，到目前为止，在拟南芥中至少发现了10个CBL和25 CIPK基因，玉米中有9个CBL和43个CIPK基因家族成员(Chen et al., 2011; Yu et al., 2007)。

CBL/CIPK互作模式对非生物逆境的应答过程中起到了很重要的作用。CBL/CIPK互作后将信号传递到下游，调控胁迫响应基因的表达，最终达到或适应某种胁迫平衡。尽管目前对CBLs/CIPKs有相关研究报道，但是对农作物中众多CIPKs功能研究依然较少。同时,由于不同逆境本身之间存在信号交叉，而且某一逆境可能产生多种Ca²⁺信号，使得整个CBL/CIPK信号系统变得复杂化、多样化。因此，依赖于Ca²⁺的CBL/CIPK信号系统也相当错综复杂且有其特异性(Weinl and Kudla, 2009)。

本研究以玉米为研究材料，通过分析了ZmCIPK42基因在不同逆境下的表达情况，为CIPK参与的逆境相关调控通路提供相关理论依据，同时为农作物抗逆分子育种提供候选基因。

1结果与分析
1.1玉米ZmCIPK42克隆及序列分析
根据文献报道(Chen et al., 2011)，通过MaizeGDB数据库序列比对，在B73基因组中找到一个具有CIPK保守结构域的基因，该基因命名为ZmCIPK42，MaizeGBD登录号为：GRMZM2G011919，ZmCIPK42蛋白与玉米CIPK15、水稻、小麦及其大麦中的CIPK14 高度同源，其序列一致性超过73%，ZmCIPK42编码区的长度为1 323 bp，编码一个含440氨基酸的多肽，该多肽的相对分子质量为49.8 kD。它含有N端激酶结构域和在CIPK家族中高度保守的C端NAF调节结构域(图1)。ZmCIPK42位于4号染色体．它的基因组DNA不包含内含子。以玉米cDNA为模板扩增ZmCIPK42 (图2)，扩增PCR产物与pGEM-T载体连接后送测序，测序结果与原序列一致。

图1 玉米ZmCIPK42与其它物种CIPK蛋白序列比对分析 Figure 1 Amino acid alignment between maize ZmCIPK42 and other CIPKs

图2 ZmCIPK42全长cDNA序列扩增 Figure 2 Amplification of ZmCIPK42 full length cDNA sequence

1.2 ZmCIPK42的系统发育树分析
为研究玉米ZmCIPK42和拟南芥CIPK基因家族及其他作物同源CIPK基因进化关系，构建CIPK基因家族之间的进化树(图3)。拟南芥CIPK基因明显的被分成含多内含子和少内含子两个分支，ZmCIPK42、水稻CIPK14、小麦CIPK14和大麦CIPK14以及玉米中另外一个ZmCIPK15分在少内含子组内，这个结果表明拟南芥和玉米中这两个亚家族的祖先在单、双子叶植物分离之前就已经存在。拟南芥和玉米CIPK基因聚在一起很可能是存在共同的祖先。这个结果与拟南芥和水稻中已有报道是一致的(Jain et al., 2006; Zhang et al., 2005)。

图3 ZmCIPK42进化分析 Figure 3 Phylogentic analysis of ZmCIPK42

1.3 ZmCIPK42逆境胁迫后表达特异性分析
为研究在非生物逆境下玉米中ZmCIPK42在转录水平上的变化情况，对不同胁迫处理的玉米幼苗做实时定量PCR检测，结果显示在盐胁迫(250 mmol/L NaCl)条件下，ZmCIPK42的表达量随着时间胁迫延长表达量逐渐升高，在胁迫12 h时达到最大，达到3.5倍，随后略微下降；在热胁迫(42℃)开始后的1 h之内，ZmCIPK42表达量迅速升高达到3倍以上，随后呈下降趋势；在脱水处理下，ZmCIPK42的表达量先呈下降趋势，随后表达量逐渐升高，24 h后表达量达到未处理的2倍左右。经过ABA处理及冷处理后ZmCIPK42的表达量随胁迫时间延长变化不明显(图4)。由此可见，ZmCIPK42在转录水平上与各种盐碱、高温、干旱都有着一定的应答关系，只是在表达时间及表达量上有一定的区别。

图4 ZmCIPK42在不同胁迫条件下表达量 Figure 4 Relative expression of ZmCIPK42 under different stresses

2讨论
2.1 ZmCIPK42克隆及序列分析
本研究克隆得到的玉米中编码CIPK蛋白激酶的基因，它的核酸和蛋白序列与拟南芥，水稻和大麦具有高度的一致性，尤其是N-端的催化结构域和C-端的调节结构域。此外，研究还发现ZmCIPK42与之前报道的OsCIPK14相似，都具有1个外显子(Kurusu et al., 2010)，由此推测玉米及水稻CIPK家族的计划具有很高的共线性。另外，结合拟南芥和水稻中的AtCIPK2、AtCIPK10和OsCIPK14，可以看出玉米、水稻和拟南芥等高等植物中大部分CIPK基因高度保守，可推测ZmCIPK42能够感受Ca²⁺信号，并参与植物生物胁迫和非生物胁迫的反应。当然这需要进一步详尽的实验验证，这些结果为玉米ZmCIPK42基因的功能研究提供了一些有益的线索。

2.2 ZmCIPK2基因的表达特性及可能的生物学功能
许多研究表明干旱和高盐共同诱导的基因之间有很大一部分是重叠的，这个结果也证实了很多非生物逆境胁迫会导致细胞脱水，打破细胞内渗透平衡(Nambara and Marion-Poll, 2005)。对于ZmCIPK42基因在不同逆境下的转录水平的研究表明不仅在干旱、高温和盐胁迫之间，存在很高的相关性，这些结论和上面提到的观点和结论是一致的。另外，很多受ABA诱导的基因也被干旱脱水和高盐诱导，意味着很多玉米CIPK基因参与了ABA、干旱和高盐共同的信号途径。以往的研究结果也表明植物对高盐、干旱引起的渗透胁迫的应答机制可以通过依赖于ABA和不依赖于ABA的两条途径启动(Chinnusamy et al., 2004)。研究发现ZmCIPK42经过胁迫后却不被ABA所诱导，这个结果说明了被干旱、高温和盐诱导的玉米ZmCIPK基因所参与的相应逆境应答信号途径也可能不依赖于ABA的途径启动。

3材料和方法
3.1实验材料
大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α，购自天根生物科技有限公司。LA Taq酶、SYBR Green Mix购自TaKaRa公司，pGEM-T Easy载体、T₄ DNA连接酶购自Promega公司，全长扩增引物ZmCIPK42-F：5'-ATGAACACCAGAGGGAAGAC-3'；ZmCIPK42-R：5'-CTACAGATCATCTCCATGCCAGGCC-3'及Real-time PCR引物ZmCIPK42-Q1-F：5'-AACATTGTCAGCATTGAAGGGAGGA-3'，ZmCIPK42-Q1-R：5'-GAATGTAGTTGCTAAAAAAAATAAG-3'由上海生工生物技术有限公司合成。

本研究中所用的玉米自交系B73为中国农业科学院王国英教授惠赠，目前，玉米自交系B73基因组测序已完成，B73常被用来配制不同杂交组合系的研究材料，因此其基因组的测序能够为人们详细的基因标记，还能帮助育种家选育新品种。

3.2序列比对、分析与进化树构建
拟南芥和玉米部分CIPK基因序列从已有文献中获取(Kolukisaoglu et al., 2004)。为了得到玉米中的CIPK42基因序列，首先用文献报道的玉米部分核苷酸序列和玉米的基因组序列数据库(http://www.maizesequence.org) 进行比对，获得玉米B73基因中的同源基因。将检索到的基因序列利用 InterProScan 分析这些候选基因中是否含有 CIPK 基因的特征功能域NAF (FISL motif, access. no PF03822)。根据水稻及拟南芥中已知的CIPK序列，然后利用NCBI结合Genedoc软件进行同源性及保守结构域分析。

蛋白多序列比对由CLUSTAL_X version 1.83构建，使用软件默认参数。根据比较结果，用MEGA4软件构建系统进化树，构建时采用neighber-joining方法建树，自展1 000次，“Pairwise delrtion”处理空位和缺失数据，其它参数保持默认(Tamura et al., 2007)。

3.3玉米幼苗的逆境胁迫处理
将玉米自交系B73种子播在装有沙子的花盆中，培养箱中14 h光/10 h暗生长。当玉米幼苗生长至三叶期后准备进行各种逆境处理。ABA处理：从花盆中取出整个植株，洗去根部的沙子，用水培的条件，在Hoagland 营养液中进行适应培养1 d，将平衡培养过的幼苗放入含100 μmol/L ABA的Hoagland营养液中，按0、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h时间点取样；NaCl处理：从花盆中取出整个植株，洗去根部的沙子，在Hoagland营养液中进行适应培养1 d，将平衡培养过的幼苗放入含250 mmol/L NaCl的Hoagland 营养液中，按0、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h时间点取样；低温处理：将生长在花盆中的幼苗直接放入4℃培养箱中低温处理，按 0、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h时间点取样；高温处理：将生长在花盆中的幼苗直接放入42℃培养箱中高温处理，按 0、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h时间点取样；自然脱水处理：把幼苗取出后放在脱水滤纸上自然脱水，按0、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h时间点取样。

3.4 ZmCIPK42基因在不同胁迫条件下实时定量RT-PCR 分析
所有样品处理完后，提取植株RNA，并对RNA 进行均一化处理，以玉米三磷酸甘油醛脱氢酶基因GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 基因收录号: X07156) 作为Real-time PCR的内标基因。根据ZmCIPK42序列设计特异性引物，PCR体系为：2×SYBR Green混合液10 μL，模板cDNA (反转录稀释液) 2.0 μL，稀释合适浓度的正、反向引物1 μL，补充去离子水至20 μL。PCR程序反应：95℃，1 min；94℃，15 s，60℃，20 s，72℃，30 s；循环40次，读数在72℃延伸阶段，循环结束后，构建熔解曲线。数据处理采用相对定量2^-△△Ct方法来计算基因在某种逆境处理下某个时间点相对于对照的转录水平变化(Livak and Schmittgen, 2001)，

作者贡献
陈勋基、陈果和邵琳是本研究的实验设计和研究的执行人；陈勋基和陈果完成数据分析；邵琳参与实验设计，试验结果分析；陈勋基和黄全完成论文的写作和修改；黄全生是项目的总构思者和负责人，指导实验设计，数据分析。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2009211B30)和新疆维吾尔自治区高技术研究计划项目(201011109)共同资助。作者感谢中国农业科学院作物科学研究所郑军老师在本实验过程中的指导。

参考文献
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